使用快速冲洗CE-SDS分离方法提高lgG纯度分析的检测通量
High Throughput Detection of IgG Purity by Using Quick Rinse CE-SDS Separation Method
高铁，刘冬科，陈泓序
Gao Tie, Liu Dongke, Chen Hongxu
SCIEX，中国
SCIEX, China
Key Words : CE-SDS; Quick Rinse; PA 800 Plus; Capillary Gel Electrophoresis; IgG
Abstract
Since it was written into the Chinese Pharmacopoeia in 2015, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (CE-SDS) has been widely used by major biopharmaceutical companies to monitor the impurities produced in the production process of therapeutic mAb products that may affect drug efficacy or patient safety, providing purity related detection data for product release. In order to meet the demand of higher throughput and faster detection in biopharmaceutical companies, the CE-SDS separation method with rapid rinse was introduced for the separation and purity analysis of monoclonal antibodies. Under the rapid rinse separation method, the rinsing time was significantly reduced. The rinsing time in the analysis method of monoclonal antibody prepared by reduction method (IGG-R) and monoclonal antibody prepared by non-reduction method (IGG-NR) was reduced from 15 min to 3 min, saving 12 min per injection. Under these conditions, the migration time of each peak, the percentage of corrected peak area, and the separation degree of each peak in LG-R and LG-NR samples with eight consecutive needles were investigated in this technical description, and the statistical results showed good reproducibility. In the reduction results, the RSD of migration time and corrected area percent of LC/HC were all less than 1%, and the resolution of NGHC and HC were all more than 1. In the non-reduction results, the RSD of migration time and corrected area percent of the main peak were all less than 1%, and the resolution of main peak and HHL was more than 0.9, which met the system applicability standards required by pharmacopoeia. This method can effectively shorten the detection time and improve the sample analysis efficiency.
1. 前言
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（CE-SDS）从2015年写 入中国药典以来，被各大生物制药公司广泛用于监测治疗性单抗产 品在生产过程中产生的可能影响药物疗效或患者安全的杂质，为产 品放行提供了纯度相关的检测数据。 随着生物制药公司项目的增多，相关单抗的检测数量也急剧上 升。为满足生物制药企业更高通量，更快速检测的需求，本文介绍 了快速冲洗的CE-SDS分离方法用于单抗类药物的分离和纯度分析。 在快速冲洗分离方法下，针间冲洗时间大幅减少，还原法制备单抗 类药物（IgG-R）和非还原法制备单抗类药物（IgG-NR）分析方法 中的针间冲洗时间由之前的15 min减少至3 min，每针节省12 min； 在该条件下，本技术说明考察了连续8针lgG-R、lgG-NR样品中各峰 迁移时间、校正峰面积百分比、分离度，统计结果均显示出良好的 重现性。还原结果中LC和HC的迁移时间、校正峰面积百分比的RSD 均小于1，NGHC和HC的分离度均大于1；非还原结果中主峰的迁移 时间、校正峰面积百分比的RSD均小于1，分离度均大于0.9，并符 合药典要求的系统适用性标准。该方法可有效缩短检测时间，有利 于提高样品的采集通量和分析效率。
2. 仪器和试剂
2.1 仪器
SCIEX PA 800 Plus药物分析系统，配备二极管阵列检测器 （PDA，波长220 nm），32 Karat™软件10.1（SCIEX）；离心机；分 析天平；金属浴。
2.2 试剂及耗材
lgG Purity/Heterogeneity Assaay Kit（PN：A10663），该试剂盒 内容见表1。2- 巯基乙醇（ Sigma-Aldrich PN M7154 ），碘乙酰胺 （Sigma-Aldrich PN I1149）。Centricon YM-30超滤管（Millipore PN 4208）。
250 mM碘乙酰胺配置：称取碘乙酰胺46 mg，加入去离子水 1 mL。盖紧瓶盖然后充分混匀直到完全溶解，尽快取用并避免光 照。碘乙酰胺需现用现配，避光保存。
表1. lgG Purity/Heterogeneity Assay Kit
2.3 样品及前处理
本实验所用lgG样品浓度为10 mg/mL，且所含盐的终浓度小于 50 mmol/L（如超出，需进行超滤），准备两个1.5 mL离心管，分 别依次加入10 μL样品溶液、90 μL样品缓冲液（100 mM Tris-HCl， pH 9.0，1%SDS）、2 μL 10 kDa内标，其中一个离心管加入5 μL 2-巯 基乙醇作为还原法制备lgG样品，另一个离心管加入5 μL碘乙酰胺溶 液作为非还原法制备lgG样品。盖上瓶盖，充分混合后离心1 min。 然后置于70 ℃金属浴10 min。取出后冷却即可上机实验。
2.4 运行方法
PA 800 Plus毛细管电泳仪，检测器：PDA，220 nm ；采集频 率：4 Hz；样品室温度：25 ℃；毛细管温度：25 ℃；窗口狭缝：2 号（200 μm ×100 μm）；毛细管：熔融石英毛细管， 内径50 μm， 20/30.2 cm 有效/总长。
还原法制备单抗类药物（lgG-R），非还原法制备单抗类药物 （lgG-NR）的CE-SDS快速冲洗分离方法与常规CE-SDS分离方法的 时间对比见表2。在常规分离方法的基础上，lgG-R、lgG-NR快速冲 洗分离方法均取消了NaOH，HCl，H2O的冲洗，并将SDS Gel的冲 洗时间由原来的10 min缩短至3 min。IgG-R分析中电压分离时间为 25 min，lgG-NR分析中电压分离时间为35 min。
表2. lgG-R、lgG-NR CE-SDS快速冲洗分离方法与常规CE-SDS分离方法时间 对比表
3. 分析与讨论
快速冲洗CE-SDS分离方法对IgG还原、非还原样品的分析见图 1。使用2-巯基乙醇进行样品还原处理，lgG-R快速冲洗分离方法采 集得到了lgG-R分析结果，见图 A；连续8针采集的lgG-R样品叠加谱 图见图 C。使用碘乙酰胺进行样品非还原处理，lgG-NR快速冲洗分 离方法采集得到了lgG-NR分析结果，见图B；连续8针采集的lgG-NR 样品叠加谱图见图 D。
8针lgG-R和lgG-NR样品的迁移时间，校正峰面积百分比，分离 度的重现性数据见表3。lgG-R分析中，轻链（LC）、重链（HC）迁移时间RSD＜0.3%，且第1针和第8针重链的绝对迁移时间仅相 差0.02 min，LC、HC校正峰面积百分比RSD＜0.1%，非糖化重链 （NGHC）和HC的分离度均大于1.3。lgG-NR分析中，lgG主峰迁 移时间 RSD＜0.2%，且第1针和第8针主峰的绝对迁移时间仅相差 0.02 min，校正峰面积百分比 RSD＜0.05%，IgG主峰与重重轻链 （HHL）分离度均大于0.9。
图1. 快速冲洗CE-SDS分离方法对IgG还原、非还原样品的分析。A. IgG-R样 品分析图谱，B. IgG-NR样品分析图谱，C. IgG-R重复性考察图谱（n=8）， D. IgG-NR重复性考察图谱（n=8）
表3. 快速冲洗分离方法下IgG-R和IgG-NR重复性数据统计（n=8） （MT: 迁移时间，min；CAP: 校正峰面积百分比， %；R: 分离度，USP）
